Abstract

The human protein p54^nrb have been implicated in a variety of nuclear processes including transcription, pre-mRNA processing, nuclear retention of edited RNA and DNA relaxation. We have identified p54 ^nrb as an antigen of the phosphodependent monoclonal antibodies CC-3 and MPM-2 and shown that this protein is phosphorylated on multiple sites during mitosis. The use of the cyclin-dependent protein kinase inhibitor roscovitine and immunodepletion studies with an anti-cyclin B1 antibody established that Cdk1 was responsible for the phosphorylation of p54^nrb. We also show that p54^nrb is a target of the peptidylprolyl isomerase Pin1, suggesting that it may be regulated by phosphorylation-dependent conformational changes. In addition, site directed mutagenesis indicated that the interaction of Pin1 with p54^nrb was mediated by three threonine residues located in the proline-rich carboxy-terminal extremity of the protein. Our results also showed that Pin1 binding is favored when at least two of the three threonine residues were phosphorylated, suggesting a regulation mechanism based on multisite phosphorylation.

Alternate abstract:

La protéine humaine p54^nrb a été impliquée dans divers processus nucléaires, notamment la transcription, le traitement des pré-ARNm, la rétention nucléaire de l'ARN modifié et la relaxation de l'ADN. Nous avons identifié p54^nrb comme un antigène des anticorps monoclonaux phosphodépendants CC-3 et MPM-2 et montré que cette protéine est phosphorylée sur plusieurs sites au cours de la mitose. L'utilisation de la roscovitine, un inhibiteur de la protéine kinase dépendant de la cycline, et des études d'immunodéplétion avec un anticorps anti-cycline B1 ont établi que Cdk1 était responsable de la phosphorylation de p54^nrb. Nous montrons également que p54^nrb est une cible de la peptidylprolyl isomérase Pin1, ce qui suggère qu'elle pourrait être régulée par des changements conformationnels dépendants de la phosphorylation. De plus, la mutagenèse dirigée sur le site a indiqué que l'interaction de Pin1 avec p54nrb était médiée par trois résidus thréonine situés dans l'extrémité carboxy-terminale riche en proline de la protéine. Nos résultats ont également montré que la liaison de Pin1 est favorisée lorsqu'au moins deux des trois résidus thréonine sont phosphorylés, suggérant un mécanisme de régulation basé sur la phosphorylation multisite.