Abstract

La poly(ADP-ribosyl)ation est une modification post-traductionnelle des proteines faisant partie d'un systeme de surveillance de l'integrite genomique. Lors de la mort cellulaire programmee, la poly(ADP-ribose) polymerase est specifiquement clivee par les proteases apoptotiques de la famille des caspases. Afin de mieux comprendre le role du metabolisme du poly(ADP-ribose) et du clivage de la PARP lors de l'apoptose, j'ai recree et caracterise l'interaction entre la PARP, le dommage a l'ADN et les proteases apoptotiques a l'aide d'enzymes purifiees. Cette approche m'a permis de demontrer que les bris simple brin et double brin induits par les rayons ɣ dans l'ADN pouvaient directement stimuler l'activite catalytique de la PARP. Par la suite, j'ai caracterise le clivage de la PARP par granzyme B, une protease apoptotique des lymphocytes cytotoxiques. Pour ce faire, j'ai developpe un nouveau schema de purification de la PARP afin d'obtenir une enzyme purifiee de ses fragments de degradation. Nous avons ensuite demontre que granzyme B clivait la PARP in vitro et in vivo en des fragments differents de ceux produits par les caspases et que les fragments generes par les caspases etaient majoritaires en presence des deux enzymes in vivo. Finalement, j'ai etudie l'influence de la liaison a l'ADN et de la mono(ADP-ribosyl)ation de la PARP sur sa proteolyse. Les evidences experimentales ont indique que l'automodification de la PARP avec de courtes chai nes d'oligo(ADP-ribose) n'inhibait pas son clivage. Cependant, nous avons observe que la liaison de l'enzyme a l'ADN contenant des bris simple brin et double brin ralentissait considerablement la cinetique de la proteolyse de la PARP catalysee par caspase 3.

Alternate abstract:

Poly(ADP-ribosyl)ation is a post-translational modification of proteins that is part of a genomic integrity monitoring system. During programmed cell death, poly(ADP-ribose) polymerase is specifically cleaved by apoptotic proteases of the caspase family. To better understand the role of poly(ADP-ribose) metabolism and PARP cleavage during apoptosis, I recreated and characterized the interaction between PARP, DNA damage and apoptotic proteases. using purified enzymes. This approach allowed me to demonstrate that single-strand and double-strand breaks induced by ɣ rays in DNA could directly stimulate the catalytic activity of PARP. Subsequently, I characterized the cleavage of PARP by granzyme B, an apoptotic protease of cytotoxic lymphocytes. To do this, I developed a new PARP purification scheme in order to obtain an enzyme purified of its degradation fragments. We then demonstrated that granzyme B cleaved PARP in vitro and in vivo into fragments different from those produced by caspases and that the fragments generated by caspases were the majority in the presence of the two enzymes in vivo. Finally, I studied the influence of DNA binding and mono(ADP-ribosyl)ation of PARP on its proteolysis. Experimental evidence indicated that self-modification of PARP with short oligo chains (ADP-ribose) did not inhibit its cleavage. However, we observed that binding of the enzyme to DNA containing single-stranded and double-stranded breaks significantly slowed the kinetics of caspase 3-catalyzed PARP proteolysis.